產(chǎn)品英文名：pMD™18-T Vector Cloning Kit

產(chǎn)品中文名：PMD18-T Vector 載體

制品內(nèi)容

pMD 18-T Vector (50 ng/μl) 20 μl × 1 支

Control Insert (50 ng/μl) 10 μl × 1 支

Solution I* 75 μl × 2 支

*使用時(shí)請(qǐng)于冰中融解。  

制品說(shuō)明

pMD 18-T Vector是一種克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的載體。本載體由pUC18載體改建而成，在pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的Xba I 和Sal I 識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoR V 識(shí)別位點(diǎn)，用EcoR V 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3′端添加 “T” 而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR 產(chǎn)物的3′末端添加一個(gè) “A” 的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。

由于本載體以pUC18載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，所以它具有同pUC18載體相同的功能。此外，本制品中的連接液Solution I 可以在短時(shí)間內(nèi) (約30分鐘) 完成連接反應(yīng)，其連接液可以直接用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。本制品中的Control Insert (500 bp) 還可以用于Control反應(yīng)。

保存

-20℃。

純度

Control Insert經(jīng)克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。

用途

1. 進(jìn)行TA克隆，克隆PCR產(chǎn)物。

2. 對(duì)克隆后的PCR產(chǎn)物使用BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers進(jìn)行DNA測(cè)序。

pMD 18-T Vector的結(jié)構(gòu)

注意事項(xiàng)

1. Solution I 請(qǐng)于冰中融解。

2. 克隆時(shí)使用的Insert DNA片段 (PCR產(chǎn)物) 建議進(jìn)行切膠回收純化，否則PCR產(chǎn)物中的短片段DNA (甚至是電泳也無(wú)法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會(huì)影響TA克隆效率。

3. 按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的連接液不要超過(guò)20 μl。當(dāng)要轉(zhuǎn)化的DNA量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，需對(duì)連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。進(jìn)行乙醇沉淀時(shí)使用Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No.: 9094) 可以提高DNA的回收率。

4. 連接反應(yīng)請(qǐng)?jiān)?5℃以下進(jìn)行，溫度升高 (>26℃) 較難形成環(huán)狀DNA。連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間至數(shù)小時(shí)。

5. 本制品來(lái)源于pUC18載體，因此，適合pUC18載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用，如：JM109等。

特別應(yīng)用推薦：

胰島素DNA克隆^[3]

參考文獻(xiàn)

1. Wu GW, Tang M, et al. The epitope structure of Citrus tristeza virus coat protein mapped by recombinant protein sand monoclonal antibodies. Virology. 2014 Jan 5;448:238-46.

2. Hu LL, Cui RQ, et al. Molecular and biochemical characterization of the β-1,4-endoglucanase gene Mj-eng-3 in the root-knot nematode Meloidogyne javanica. Exp Parasitol. 2013 Sep;135(1):15-23.

3. 攜帶人胰島素基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，劉毅，et al.